Достижения и перспективы в идентификации генов предрасположенности к ревматическим заболеваниям

Д-р мед. наук В.А.Мякоткин
(Институт ревматологии РАМН)

Лечение ревматических заболеваний в Израиле Бесплатная заочная консультация врача-ревматолога

Этиология большинства ревматических заболеваний, широко распространенных среди населения, и в настоящее время остается не вполне ясной, что обусловливает широкий поиск как средовых, так и генетических факторов, ответственных за их этиологию.

В Институте ревматологии систематические исследования структуры наследственной предрасположенности к ревматическим заболеваниям проводятся в течение последних 25 лет с использованием генеалогического, близнецового, популяционно-генетического, иммуногенетического и молекулярно-генетического методов исследования.

Проведенные нами исследования, также как и работы зарубежных авторов, показали, что вклад генетических факторов в детерминацию ревматических заболеваний превалирует над вкладом средовых факторов. Это открывает перспективы поиска генов предрасположенности к ревматическим заболеваниям с использованием методологии «обратной генетики». Стратегия «обратной генетики» применительно к поиску генов предрасположенности на первом этапе подразумевает их локализацию на конкретном участке конкретной хромосомы (т.е. картирование) с помощью анализа сцепления с генетическими маркерами, хромосомная локализация которых уже известна. Анализ сцепления представляет собой проверку совместного или независимого наследования заболевания и генетических маркеров в семьях. Чем ближе на хромосоме расположены ген предрасположенности к заболеванию и гены генетических маркеров, тем чаще они наследуются совместно в родословных, что позволяет с помощью показателей частоты рекомбинации между ними определить хромосомную локализацию гена чувствительности. Количественным показателем сцепления является логарифм соотношения шансов за и против его наличия в обследованной семье - лод-балл. Суммарная величина лод-баллов для выборки семей, равная +3,0 и более (что соответствует вероятности р=0,001 и менее), свидетельствует о наличии сцепления, тогда как величина -2,0 и менее - о его отсутствии.

Для выявления гена предрасположенности с помощью анализа сцепления используются в основном два подхода: а) отбираются гены-кандидаты на роль главного гена и исследуется их полиморфизм в информативных семьях с последующим подсчетом лод-баллов, причем отрицательное значение этого показателя (-2,0 и менее) позволяет однозначно исключить ген-кандидат из претендентов на роль главного гена; б) подбираются полиморфные, достаточно информативные (с высоким уровнем гетерозиготности) ДНК-маркеры (от 15 и более на хромосому), проводится тестирование семей с последующим анализом сцепления между заболеванием и всеми использованными маркерами. Полученные в результате такого анализа значения лод-баллов помогают определить сегмент хромосомы, в котором может быть локализован ген предрасположенности к заболеванию.

Таким образом, методология «обратной генетики» открывает возможности для поиска генов предрасположенности, не имея предварительной информации о их количестве, функции и значимости в этиопатогенезе заболевания.

В рамках вышеизложенной методологии в последние годы был проведен широкий поиск генов чувствительности к ряду ревматических заболеваний. Так, Shiozawa и соавт. (1997) на семьях с повторными случаями ревматоидного артрита проскринировали все хромосомы, использовав для этой цели 358 полиморфных ДНК-маркера. В результате проведенной работы методом анализа сцепления были выделены два перспективных для поиска генов чувствительности к ревматоидному артриту участка на Х-хромосоме, в которых локализованы ген рецептора фактора некроза опухолей и ген лиганда CD40, являющихся, по мнению авторов, генами-кандидатами предрасположенности к PA. F.Cornelis и соавт. (1997), использовав сходную методологию, выявили два критических хромосомных участка, маркеры которых сцеплены с ревматоидном артрите и могут содержать гены чувствительности к заболеванию. Один из этих участков располагается на Х-хромосоме (локализация соответствует данным японских авторов), тогда как другой расположен в том же самом сегменте 3-й хромосомы, где и ген IDDM9, являющийся одним из генов, детерминирующих чувствительность к инсулинзависимому диабету. По данным авторов, вклад этого гена в детерминацию заболевания составляет около 27%.

Нами проведен анализ сцепления в двух, трех и четырех поколениях сорока семей с повторными и множественными случаями ревматоидного артрита с рядом генов-кандидатов, в число которых входили HLA локусы (6-я хромосома), гены α-цепей коллагена I и II типов (COLIA2 и COLIIA1, 7-я и 12-я хромосомы соответственно), гены β (TCRB - 7-я хромосома), а- и 8-цепей (TCRA и TCRD - 14-я хромосома) Т-клеточного рецептора, а также с маркерами D18S63 и D18S452, которые были выбраны в связи с имеющимися в литературе данными о повышенной частоте ревматоидного артрита среди носителей делеции в коротком плече 18-й хромосомы, где и локализованы эти маркеры. Для всех исследованных маркеров (табл. 2.1), кроме маркеров TCRD, были получены отрицательные значения лод-баллов, что позволяет отвергнуть по крайней мере тесное сцепление с вышеперечисленными генами и исключить их из числа генов чувствительности к ревматоидному артриту. Для анализа сцепления ревматоидного артрита с TCRD в качестве маркера был использован 6-аллельный динуклеотидный GT повтор с высоким уровнем гетерозиготности (0,74), локализованный в 3-м интроне этого гена. Для анализа сцепления с данным маркером оказались пригодными 14 семей (149 человек, из них 35 больных ревматоидным артритом). Максимальный лод-балл был равен +1,68 при RF=Q,0 у обоих полов. Подобное значение лод-балла не может рассматриваться в качестве строгого доказательства наличия сцепления, однако является достаточно серьезным указанием на его вероятность, особенно при анализе сцепления гена с неполной пенетрантностью. Для подтверждения полученных оценок возможной сцепленности TCRD гена с главным геном ревматоидного артрита был использован другой ДНК-маркер - ПДРФ, связанный с точковой изменчивостью TCRD гена в положении NT 256 и выявляемый рестриктазой RamH I. Однако этот маркер менее информативен для анализа сцепления (гетерозиготность, по данным литературы, равна 0,32), что существенно повышает требования к точности оценок частот его аллелей, в связи с чем были обследованы 36 здоровых лиц из московской популяции. Полученные опенки аллельных частот практически не отличались от таковых в среднеевропейских популяциях. Анализ сцепления был проведен на 15 информативных поданному маркеру семьях (167 человек, 37 больных ревматоидным артритом). Максимальный лод-балл составил +0,6 при частоте рекомбинации, равной 0,08 для обоих полов. Результаты изучения аллельных ассоциаций маркерного GT повтора и ревматоидного артрита выявили статистически значимое увеличение частоты носительства редкого аллеля Е1 среди больных ревматоидным артритом с системными проявлениями по сравнению со здоровыми лицами. Показатель относительного риска (ОР) составил 3,9. Мы также изучили распределение аллельных вариантов динуклеотидного GT повтора среди больных системной склеродермией, анкилозирующим спондилоартритом и в контрольной группе здоровых индивидуумов. Среди больных системной склеродермией отмечались повышенная частота аллеля Е2 (ОР=3,22) и сниженная частота аллеля Е1 (ОР=0,3). Распределение аллельных вариантов GT повтора у больных анкилозирующим спондилоартритом статистически значимо не отличалось от такового в контрольной группе.

Результаты тестирования генов-кандидатов предрасположенности к ревматоидному артриту

VNTR - вариабельный тандемный нуклеотидный повтор. ПДРФ - полиморфизм длины рестриктных фрагментов Rsal, BamHi - рестриктазы.

Сопоставимые с нашими данные были представлены Hall и соавт.. Ими было получено также положительное значение лод-баллов (+0,65) для одного из маркеров TCRA локуса, расположенного в том же самом сегменте (ql1) 14-й хромосомы, что и изученный нами локус TCRD. Помимо этого, Cornells и соавт. (1996) изучили ДНК полиморфизм V6, V7, V8 и V10 TCRA генов, кодирующих синтез вариабельного участка а-полипептидной цепи Т-клеточного рецептора. Было выявлено увеличение частоты аллеля 2(+) V8 гена у больных ревматоидным артритом. Значимость этой ассоциации была подтверждена на 2 других независимых европеоидных выборках. В совокупности эти результаты позволяют рассматривать хромосомный сегмент qll 14-й хромосомы как перспективный для дальнейшего поиска гена предрасположенности к ревматоидному артриту. Интересно отметить, что в этом же хромосомном сегменте локализованы ген серин-эстеразы 1, ассоциированный с цитотоксичностью Т-лимфоцитов (GZMB), ген матричной металлопротеиназы 14 (ММН14), ген транскрипционного фактора ингибитора каппа легких цепей В-лимфоцитов (NFkBI), локализованный в 14q 12 хромосомном сегменте, определенная значимость которых в этиопатогенезе ревматоидного артрита подтверждена последними исследованиями зарубежных авторов.

Другой возможный вариант трактовки полученных результатов: сами гены 8-полипептидной цепи Т-клеточного рецептора (TCRD) являются одними из генов предрасположенности к ревматоидному артриту. В связи с этим представляют интерес некоторые особенности γ/δ Т-клеточного иммунитета, приведенные ниже.

1. γ/δ Т-лимфоциты в отличие от α/β Т-лимфоцитов негативны по CD4 и CD8, но так же, как и В-лимфоциты, позитивны по CD3. Однако CD3 сегмент 8-цепи более вариабельный, чем у иммуноглобулиновых цепей В-клеток.

1. Повышенное содержание γ/δ Т-клеток отмечено: а) при микобактериальных инфекциях (лепра, туберкулез), листериозе, стрептококковой и стафилококковой инфекциях и др.; б) при инфицировании вирусом Эпштейна-Барр, ВИЧ; в) при паразитарных инфекциях (лейшманиозе, шистосомозе).
2. Пул γ/δ Т-клеток подразделяется на две субпопуляции - V81 (негативные по CD45 RO) и Vδ2 (позитивные по CD45 RO). Количество Vδ1 Т-клеток уменьшается с возрастом, тогда как количество Vδ2 Т-клеток увеличивается с возрастом. Блокада CD45 RO антигенной детерминанты моноклональным антителом предотвращает развитие аллергического энцефаломиелита в эксперименте.
3. Vδ1 Т-клетки распознают эндогенные антигены и белки теплового шока (Hsp). Показано, что микобактериальные Hsp являются суперантигеном для Vδ1 клеток. Отмечена положительная динамика у больных ювенильным ревматоидным артритом при использовании в лечении белков теплового шока.
4. Показано, что в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом во много раз повышено содержание V81 Т-клеток. Отмечена аккумуляция Vδ1 Т-клеток при неспецифическом язвенном колите, аутоиммунном полигландулярном синдроме I типа. Повышенное содержание V82 Т-клеток отмечено при рассеянном склерозе, атопическом дерматите. Увеличение концентрации γ/δ Т-клеток было выявлено у больных синдромом Дауна, у которых значительно чаще встречаются аутоиммунные заболевания, лейкемия и отмечается повышенная чувствительность к бактериальным и вирусным инфекциям.
5. Иммунный ответ к эндогенным антигенам γ/δ Т-клеток не ингибируется (в отличие от α/β Т-клеток) антителами против специфичностей I и II классов главного комплекса гистосовместимости. Эндогенные лиганды, индуцирующие аутореактивность Vδ1 клеток, остаются до конца не выясненными. Предполагают, что ими в первую очередь являются белки теплового шока. Аутореактивность реализуется только в присутствии лигандов к витронектиновому рецептору (VNR), относящемуся к группе мембранных рецепторов, включающих в себя рецептор фибронектина (FNR), IIb/IIIa рецептор тромбоцитов и др.
6. γ/δ Т-клетки-киллеры экспрессируют FcyRIIIa рецепторы. Показано, что полиморфизм FcγRIIIa гена по двум отличающимся друг от друга сайтам ассоциирован с чувствительностью к СКВ.
7. γ/δ Т-клетки обладают функцией надзора над опухолевыми клетками, они распознают клетки лимфомы Burkitt, трансформированные вирусом Эпштейна-Барр. В-клетки, клетки лимфатической лейкемии и др. как в острой стадии, так и в стадии ремиссии.

Несколько отличный подход, базирующийся на данных об определенной гомологии структурных генов человека и мыши, был использован F.Tan и соавт. (1997) для выявления генов чувствительности к системной склеродермии. Ранее на инбредной линии мышей был выявлен на 15-й хромосоме участок, на котором идентифицирован ген фибриллина-1 (FBN-1), ответственный за детерминацию синдрома плотной кожи (tsk), моделирующего отдельные клинические проявления системной склеродермии у человека. Затем с помощью ряда ДНК-маркеров был изучен аналогичный мышиному сегмент 15-й хромосомы человека на популяции американских индейцев Чоктау с высокой распространенностью системной склеродермии. Было показано, что ген чувствительности к системной склеродермии локализован на участке размером в 2 сантиморганиды 15-й хромосомы, содержащем порядка 40 генов, и что носительство определенных маркерных гаплотипов (39% у больных против 7,8% у здоровых) увеличивает риск развития системной склеродермии в 7,5 раз.

Аналогичная методология была использована для идентификации генов чувствительности к СКВ. Критический хромосомный участок, несущий ген или гены чувствительности к модельной СКВ, сначала был выявлен и локализован на 1-й хромосоме у инбредных линий мышей. Затем вся 1-я хромосома была прицельно протестирована у человека. Так, Tsao и соавт., использовав ДНК-маркеры и метод анализа сцепления, показали, что один из генов предрасположенности к СКВ локализован на участке протяженностью в 5 сантиморганид в сегменте q41-42 1-й хромосомы. Следует подчеркнуть, что результаты получены на семьях, относящихся к различным расам - европеоидам, азиатам, афроамериканцам, что подчеркивает универсальность действия этого гена предрасположенности в детерминации СКВ. Вклад этого гена в формирование подверженности к СКВ по предварительной оценке составляет около 20%. В исследованиях G.Kearns и соавт. (1997) и K.Moser и соавт. (1997), проведенных на независимых выборках пораженных пар сибсов с использованием аналогичной методологии, была подтверждена локализация гена предрасположенности к СКВ в сегменте q41-42 1-й хромосомы, а также выявлены два других сегмента этой же хромосомы - q21 и q31-32, в которых могут быть локализованы гены чувствительности к СКВ. Интересно отметить, что в сегменте q21-q23 1-й хромосомы локализованы гены экспрессирующихся на В-лимфоцитах Fc-рецепторов, полиморфизм которых ассоциирован с чувствительностью к СКВ. Так, Y.W.Song и соавт. (1997), J.T.Salmon и соавт. (1997) было показано, что Н/Н гомозиготы по 131-му аллелю FcγRIIa рецептора имеют в 3 раза меньшую вероятность заболевания СКВ. J.Wu и соавт. (1997) был изучен полиморфизм другого гена семейства Fc-рецепторов - FcγRIIIa. Было показано, что V/V гомозиготные носители аллеля 176 этого гена имеют в 2 раза меньший риск заболеть СКВ без нефрита. Вероятность заболеть СКВ с развитием нефрита, для V/V гомозигот в 6 раз меньше, чем для носителей других генотипов этого гена. R.Mehrian и соавт. (1997) при изучении у больных СКВ ДНК полиморфизма гена интерлейкина-10 (IL-10), локализованного в q31-32 сегменте 1-й хромосомы и bcl-2 гена, локализованного в q21 сегменте 18-й хромосомы и ингибирующего апоптоз (запрограммированную смерть клетки), показали, что носительство аллеля 193 bcl 2-го гена и аллеля 127 IL-10 гена в раздельности умеренно повышает риск возникновения СКВ, тогда как их совместное наследование в 40 раз повышает риск развития этого заболевания.

Следует отметить, что на 1-й хромосоме также картирован ген Fas протеина (CD95), который в норме экспрессируется на мембране лимфоцитов и индуцирует апоптоз. Показано, что гены апоптоза обладают критическим регуляторным эффектом на иммунную систему. Инактивация или снижение регуляторной функции одного или более из этих генов может в части случаев вызывать аутоиммунное заболевание. Эти критические иммунорегуляторные гены получили название «аутогенов» по аналогии с онкогенами, классом нормальных клеточных генов, которые при утрате их функций обусловливают возникновение рака. В настоящее время в ревматологии активно изучается полиморфизм некоторых генов апоптоза, таких как Fas, bcl-2, р53, c-fos, c-myc. Дефект апоптоза, связанный с аутоиммунитетом и обусловленный bcl-2 геном, был выявлен у мышей линии NOD, у которых развивается не только диабет I типа, но и поражение слюнных желез, сходное с таковым при болезни Шегрена. В ряде исследований было показано, что ген р53 суперэкспрессирован в синовии больных ревматоидным артритом; в синовии и фибробластах больных ревматоидным артритом выявлены соматические мутации р53 гена, которые обусловливают его аномальную функцию и как следствие - образование паннуса и костной деструкции. Мутации Fas-гена и как следствие этого аномальный синтез Fas-протеина выявлены в ряде исследований при СКВ и ревматоидном артрите.

Интересный пример взаимодействия средовых и генетических факторов, связанный с нарушением функции аутогена, был найден у мышей инбредной линии 1рr, для которых характерно развитие системных аутоиммунных и лимфопролиферативных нарушений. Эти мыши являются носителями мутантного 1рr аллеля Fas-гена, кодирующего синтез Fas-протеина. У гомозиготных по мутантному аллелю мышей отсутствует экспрессия Fas-протеина, что приводит к дефекту апоптоза, к массивной аккумуляции лимфоцитов и развитию аутоиммунного заболевания. Молекулярный анализ дефектного Fas-гена показал, что ген разорван вследствие встраивания в его кодирующую последовательность ретровирусного мобильного генетического элемента, известного как ЕТn. Таким образом, эта находка является первым примером более общего механизма, посредством которого ретровирусы и связанные с ними эндогенные последовательности могут нарушать иммунную функцию за счет изменения экспрессии аутогенов, одним из потенциальных результатов которой может быть аутоиммунное заболевание.

Другой генетический механизм нарушения иммунной функции, присущий ретровирусам, заключается в трансактивации иммунорегуляторных генов. Геномы всех ретровирусов человека обладают способностью кодировать синтез протеинов, которые воздействуют на LTR-промотеры вируса и стимулируют транскрипцию. Эти регуляторы носят название «трансактивирущие транскрипционные активаторы tat и tax (tat у ВИЧ-1 и tax у HTLV-1 - вируса 1 Т-клеточной лейкемии человека). Хотя главная функция этих трансактиваторов - усиление транскрипции вирусного генома, выявлено, что эти протеины могут также усиливать транскрипцию определенных генов инфицированнои клетки хозяина, одновременно репрессируя экспрессию других клеточных генов. Так, было показано, что трансактивация с помощью ВИЧ-1-tat или HTLV-1-tax протеинов индуцирует активность части генов, таких как ИЛ-2, ИЛ-2 рецептор, гранулоцитомакрофагальный колониестимулирующий фактор, ИЛ-3, ИЛ-6, трансформирующий фактор роста Р-1, продукты синтеза которых принимают участие в воспалительных реакциях. Недавние исследования на трансгенных мышах подтвердили правомочность модели ретровирусной индукции воспалительных заболеваний с помощью механизмов трансактивации. Группой исследователей на трансгенных по HTLV- I гену была смоделирована болезнь, тождественная синдрому Шегрена. Другой группой исследователей были получены две линии, трансгенные по большому участку генома HTLV-1, содержащего env (envelope protein) и tax-гены. У этих мышей с высокой частотой отмечалось поражение суставов с образованием паннуса и эрозий, гистологически сходное с ревматоидным артритом.

Помимо методологии сцепления, для выявления генов предрасположенности к ревматическим заболеваниям широко используется и традиционный метод ассоциаций. Классический пример плодотворности этого подхода - идентификация антигенов и гаплотипов риска системы HLA для всех ревматических заболеваний, причем методами молекулярной генетики проводится изучение как самих генов (преимущественно II класса), так и их антигенов, что позволило сформулировать гипотезу «общего эпитопа». В то же время тот факт, что большинство носителей антигенов и гаплотипов риска не заболевают ревматическими болезнями, свидетельствует о наличии других генов чувствительности, не связанных с системой HLA. Поэтому в последние годы в качестве генов- кандидатов предрасположенности к ревматическим заболеваниям изучается полиморфизм других генов, продукты которых играют значимую роль в этиопатогенезе заболеваний, - генов интерлейкинов, факторов некроза опухолей и их рецепторов, металлопротеиназ, коллагенов, факторов роста и многих других. Так, T.Hohler и соавт. (1997) при изучении полиморфизма промоторной части гена фактора некроза опухолей (ФНОα) показали, что мутация в положении 238 у больных псориатической артропатией встречается в 32% случаев по сравнению с 7% в контроле (показатель риска OR=6,2). В то же время исследования полиморфизма ФНОα у больных ревматоидным артритом подобной ассоциации не выявили. S.John и соавт. (1997) с помощью ДНК-маркеров на пораженных парах сибсов изучили связь ревматоидного артрита с генами интерферонов (ИФα, ИФβ, ИФγ), интерлейкинов (ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6) и рецепторов интерлейкинов (ИЛ-1R, ИЛ-5R, ИЛ-8R). Более частое по сравнению со случайным совместное наследование общих аллелей среди пораженных пар отмечалось для ИФу, ИЛ-SR и ИЛ-2, что свидетельствует о значимости аллельного полиморфизма этих генов в этиопатогепезе ревматоидного артрита, особенно гена ИЛ-2.

Другим, активно развиваемым в последнее время направлением исследований в ревматологии является изучение полиморфизма регуляторных факторов, оказывающих влияние на экспрессию структурных генов. К ним относятся системы гомеобоксов - повторяющихся последовательностей ДНК, кодирующих синтез тканеспецифических белков, которые способны связывать определенные участки ДНК, выполняя таким образом регуляторные и координирующие функции, а также транскрипционные факторы (вспомогательные белки, облегчающие РНК-полимеразам прохождение основных этапов транскрипции, а также обеспечивающие тканеспецифическую экспрессию структурных генов путем взаимодействия с их промотерами).

К числу транскрипционных факторов, изучаемых при ревматических заболеваниях, относятся AP-I (взаимодействующий с промотерами генов коллагена IV типа и стромелизина), сКРОХ (взаимодействующий с геном коллагена Al), IRF-1 (интерферон и NO-синтетазу регулирующий фактор), NF-kB и др. Семейство транскрипционных факторов NF-kB вовлечено в регуляцию выработки многих молекул иммунной системы, включая молекулы адгезии, ИЛ, ПГ, ФНО и др. На основании проведенных исследований было показано, что экспрессия NF-kB повышена в клетках синовии больных ревматоидным артритом и псориатического артрита, что обусловливает повышенную выработку цитокинов и клеточную пролиферацию, т. е. NF-kB, являются одной из ключевых молекул в регуляции иммунного ответа. Интересно отметить, что ингибиторы этих транскрипционных факторов (например, IkBa и др.) уменьшают воспаление и клеточную пролиферацию, поэтому NF-kB рассматривается как мишень для генотерапии аутоиммунных, в том числе и ревматических заболеваний. Значимость полученных в последние годы результатов по идентификации генов чувствительности к ревматическим заболеваниям можно проиллюстрировать следующим примером: за рубежом в клиническую практику активно внедряются методы лечения, использующие принципы генотерапии, например лечение ревматоидного артрита растворимым рецептором ФНО, рекомбинантным рецептором ИЛ-1, пептидами Т-клеточных рецепторов и др..

В заключение следует отметить, что в результате реализации международного проекта «Геном человека» к 2002 г. планируется картировать (т.е. локализовать на хромосомах) все 80 000 структурных генов человека, что существенно упростит поиск генов чувствительности болезней с наследственным предрасположением, в том числе и ревматических, так как не будет требовать проведения трудоемких семейных исследований. Прорыва в идентификации генов предрасположенности к ревматическим заболеваниям следует ожидать в ближайшие годы, хотя и в настоящий момент полученные в этом направлении результаты достаточно впечатляющие.